近日，来自英国爱丁堡大学的Stuart J. Forbes团队在Cell Stem Cell杂志在线发表了题为Human biliary epithelial cells from discarded donor livers rescue bile duct structure and function in a mouse model of biliary disease 的文章，为临床hBECs移植再生的应用带来新希望。研究人员从废弃的肝脏中分离并扩增了人胆道上皮细胞（human biliary epithelial cells, hBECs），将hBECs移植入胆道疾病小鼠模型后，hBECs可再生并修复受损的胆管，减少肝纤维化，降低死亡率。该研究为胆道疾病提供了一种全新的治疗方式。
原代hBECs主要从器官捐献者的肝脏中分离而来。这些肝脏最初都是计划用于肝移植的，但由于后期临床评估不过关（过度脂肪变性或纤维化）而被认为不适于移植。那么这些“不合适”的肝脏还有别的应用价值吗？为了鉴定和表征具有治疗潜力的hBECs，作者从肝脏组织中分离并分选了候选hBECs群。采用的分类策略是之前用于分离具有双潜能小鼠BEC的分选方法【2】，获得了两个候选hBECs群：CD45-/CD31-/EpCAM+/CD24+/CD133-（简称为CD133-）和CD45-/CD31-/EpCAM+/CD24+/CD133+（简称CD133+）。
随后，作者对从脂肪和健康肝脏中分离出的hBECs进行了全方面的表征：（1）RNA测序（RNA-seq）全转录组分析：与增殖相关的基因上调，与免疫系统过程调控相关的基因（如MUC1、MUC5B）、炎症反应相关的基因（如IL1LR1、GPX4、ADCY5）和细胞外基质组织相关的基因（LAMB3、MMP1）下调，提示 CD133+ hBECs的再生能力可能更强。（2）评估了CD133+ hBECs细胞再生潜力：脂肪变性肝脏来源的CD133+ hBECs中显著上调的基因包括那些与细胞增殖、代谢和细胞外基质组织相关的基因；与炎症反应和趋化因子介导的信号转导有关的基因显著下调，表明hBECs的再生潜力在脂肪变性条件下增加。（3）研究了CD133-和CD133+ hBECs的克隆形成能力：与CD133- hBECs相比，CD133+ hBECs的克隆形成效率显著提高，形成的克隆经过连续传代并存活超过15周，同时保留正常的二倍体核型。（4）CD133+ hBECs可以生长为类器官，并表达胆管细胞和祖细胞标记物（例如K19、SOX9、EpCAM、STEM121和LGR5）；CD133+ hBECs也能够分化为肝细胞谱系，显示出独特的形态和转录特征，表明人和小鼠BECs之间具有相似的分化潜力。
接下来，作者将扩增后的hBECs移植到免疫受损的胆道疾病小鼠模型中以评估CD133+ hBECs群在体内的再生能力。基因敲除Mdm2（Krt19CreER Mdm2fl/fl Rag2-/- Il2rg-/-）+ DDC饮食（3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine, DDC）的小鼠表现出晚期胆道疾病的特征。在诱导产生衰老和胆道损伤后，作者在小鼠脾内注射了1×106个CD133+ hBECs（对照组注射PBS）。后续分析发现，与对照组小鼠相比较，移植CD133+ hBECs的小鼠在多个方面得到了改善：小鼠肝脏内病变减少，肝脾肿大程度减轻；胆红素水平降低；生存率显著升高，纤维化程度明显降低。随后作者还在缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury, IRI）小鼠模型中评估了hBECs的再生能力。与预期结果一致，hBECs也可以明显改善IRI小鼠的疾病表型。
进一步，作者探究了hBEC移植改善疾病表型的生物学机制。hBEC移植后，肝内胆道的解剖学结构得以恢复，多型核浸润核实质损伤也减少。移植的对照hMSCs（human mesenchymal stem cells, 间充质干细胞）以不规则的随机模式种植在小鼠实质中，表现为弥漫性浸润；相反，hBECs仅在小鼠胆道附近植入，其他组织中（例如脾脏或肺）没有hBECs，表明移植后，hBECs会进行靶向迁移。对hBEC移植后肝脏的组织学反应进行表征：与PBS对照组相比，hBEC移植肝脏中，K19+细胞水平增加，aSMA水平降低（表明星状细胞激活减少），CD45+细胞数量增加，HMGB1（high-mobility group box 1）从肝细胞的细胞质转移到细胞核，表明 hBEC 移植时存在抗炎机制。更有意思的是，hBEC移植后，K19+胆管细胞表达HNF4a，表明双潜能促再生机制的激活。作者还进行了磁共振胰胆管造影（magnetic resonance cholangiopancreatography, MRCP），以探究细胞移植对肝外胆道系统的影响。结果显示，PBS治疗组小鼠出现胆囊管闭塞、狭窄、胆囊和CBD扩张，相反，hBEC移植小鼠的CBD和胆囊直径明显减小，而胆囊管增加，表明移植可改善胆道肝外区域的狭窄。
最后，作者还开发了一种符合当前GMP规定的分离和培养工艺。该流程使用自动化步骤和符合GMP的试剂进行肝脏分离，然后进行临床级磁珠分类。在符合GMP的条件下分离细胞，并对每克新鲜人肝脏中CD133+ hBECs总数进行量化。与标准研究方案相比，CD133+ hBECs总数显著增加，从平均每克肝脏260.33 个hBECs增加到6015.33个hBECs，细胞碎片也明显减少。同时，作者发现，肝脏的保存方法（如非原位低温氧合机灌注）不会影响分离出的CD133-和CD133+ hBECs的总数。对GMP条件下分离出的CD133+ hBECs的克隆形成能力和扩增能力进行评估：hBECs在一段时间内保持其表型，hBEC纯度在第一个培养阶段后显著增加，并在后续的传代中始终保持较高的水平。值得注意的是，废弃的肝脏切片可进行冷冻，长期保存后也可有效分离hBECs，其克隆形成效率相似；扩增的hBECs也可以在液氮中无限期储存，解冻后再次用于培养。最后，CD133+ hBECs可以在2D或3D的符合GMP的支架中进行体外培养和扩增，在增殖和表达hBECs相关标志物的同时保持细胞活力。这些结果表明，肝脏切片和hBEC培养物都可以在GMP条件下分离、扩大和储存，并可作为hBECs的来源，在需要时可用于临床。
总的来说，研究人员鉴定了一个人肝脏BECs亚群，可以从受损的器官中分离出来，并在严格的GMP-compatible条件下长期培养而不产生表型漂移。hBECs移植后，细胞迁移到胆道附近，可以显著改善动物的生存、纤维化、炎症和生化肝功能。这种移植介导原生细胞的促再生作用，促进肝脏损伤的修复。该研究介绍的是一种潜在的人类治疗胆道疾病的实验方法，这一细胞疗法成功地治疗了患有胆道疾病的动物，为使用这些细胞作为胆道疾病的再生疗法提供了临床试验机会。作者认为，使该程序适应临床实践还需要确定最佳的注射途径，虽然肝动脉、门静脉和胆道系统都是细胞移植的可能途径，但在肝脏受损的情况下，每一种途径都有独特的挑战需要克服。
原文链接:
https://doi.org/10.1016/j.stem.2022.02.006
